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一篇JMCC(IF=5.055) | 教会你如何研究自噬!
1. 引言
各种工具鼠:野生型小鼠(Non),心脏特异性 Cyld转基因小鼠(TG), 心脏特异性Atg7转基因小鼠(Atg7),心脏特异性 Cyld,Atg7双转基因小鼠(Duo), Cyld全身敲除小鼠(Cyld KO) 心肌肥厚模型构建:主动脉缩窄术(TAC) 自噬流检测的方法: (1) 使用自噬相关工具药物检测LC3B-I/II转化:目前为止,通过伴随使用自噬晚期抑制剂,检测LC3B-I/II转化是自噬流检测的金指标。当使用自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1 (bafilomycinA1, Baf A1) 刺激细胞时, 细胞内自噬溶酶体降解被抑制, 此时观察到的LC3B-II的变化仅代表自噬小体数量的改变。当细胞自噬流活化后, LC3B-II的含量会在使用Baf A1的基础上进一步增加, 而当细胞自噬流阻断后, LC3B-II的含量则不会在使用Baf A1的基础上发生改变。 (2) 串联荧光标签检测细胞内自噬流:mRFP/mCherry-GFP-LC3B串联荧光蛋白是专门用于检测自噬流水平的融合蛋白, 自噬活化时GFP荧光信号在进入溶酶体后,由于pH值的下降会出现淬灭, 但是mRFP或mCherry荧光基团的pH值稳定性比GFP高, 在进入自噬溶酶体后仍能发出荧光。因此使用mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白时, 同时观察红色荧光和绿色荧光的强度变化可以准确判断细胞自噬活性。 若细胞内出现绿色荧光和红色荧光共定位, 即出现黄色荧光时表明mRFP/ mCherry-GFP-LC3B融合蛋白并未与溶酶体发生融合或自噬溶酶体中的pH值较高, 进而代表了自噬流的阻断。当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时, 代表mRFP/mCherry-GFP-LC3B融合蛋白定位于溶酶体或自噬溶酶体内, 即自噬流活化。 研究自噬常用药物: (1) 巴弗洛霉素A1 (bafilomycinA1, Baf A1):是囊泡型-ATP 酶(V-ATPase)的抑制剂, 能干扰自噬泡与溶酶体的融合, 抑制自噬性降解。 (2) 氯喹(chloroquine, CQ):是溶酶体抑制剂, 可通过抑制溶酶体酸化来抑制自噬性降解。 (3) 雷帕霉素(rapamycin):是 mTOR 抑制剂,可诱导自噬。